Instituto de Biotecnolog’a, UNAM. MŽxico.
RESUMEN (ABSTRACT)
Las part’culas pseudovirales (PPV) se obtienen mediante la expresi—n recombinante de prote’nas estructurales virales que tienen la capacidad de auto-ensamblarse en c‡psides morfol—gicamente similares a los virus nativos. La producci—n de PPV t’picamente requiere la expresi—n simult‡nea de varias prote’nas bajo ambientes intracelulares distintos a los encontrados en el huŽsped viral original, lo que puede reducir los rendimientos de ensamblaje. Por lo tanto, el desarrollo de bioprocesos para la producci—n de PPV es una tarea retadora que requiere no solamente cuantificar la prote’na recombinante de interŽs, sino tambiŽn diferenciar entre prote’nas ensambladas y desensambladas. Similarmente, es necesario que las estrategias de purificaci—n sean capaces de separar y recuperar solamente prote’nas ensambladas y libres de componentes contaminantes presentes ya sea dentro, embebidos o recubriendo las PPV. Las PPV tienen di‡metros entre de 20 y 80 nm, por lo que los mŽtodos tradicionalmente usados para purificar y caracterizar prote’nas recombinantes no son efectivos para estructuras proteicas de tal tama–o. El reto de purificaci—n de PPV se complica aœn mas con la presencia de macroestructuras adicionales, tales como los baculovirus recombinantes usados como vectores durante la producci—n en cŽlulas de insecto. En esta ponencia se discutir‡n los retos de bioprocesamiento, tanto de cultivo como de purificaci—n, durante la producci—n de PPV de rotavirus (PPR) producidas por el sistema de expresi—n de cŽlulas de insecto-baculovirus. Las PPR est‡n formadas por tres capas concŽntricas de cuatro prote’nas cuya coexpresi—n resulta en la acumulaci—n de estructuras de una, dos o tres capas. Se presentar‡n estrategias de producci—n enfocadas a minimizar la presencia de prote’nas contaminantes, incluyendo baculovirus, y mejorar los rendimientos. Igualmente, se demostrar‡ la utilidad del empleo de diversas metodolog’as novedosas, entre ellas dispersi—n din‡mica de luz y electroforesis capilar zonal, para la caracterizaci—n y purificaci—n de PPV. A travŽs de tales metodolog’as se dise–aron estrategias de purificaci—n que logran discriminar entre diversas PPV y otras estructuras virales de interŽs. Como resultado de este trabajo se ha logrado producir PPV altamente puras, con altos rendimientos y bien caracterizadas. Se discutir‡ la importancia de este trabajo en el contexto de la producci—n de vacunas de nueva generaci—n.